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細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)新方法(二)--實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)
案例:細(xì)胞作為趨化因子
上篇ibidi細(xì)胞趨化應(yīng)用中(見鏈接: )以Dendritic cell對(duì)CCL19細(xì)胞趨化反應(yīng)為例介紹了細(xì)胞趨化的新方法。
本案例將介紹如何用細(xì)胞作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的化學(xué)趨化因子。
如圖所示:觀測(cè)通道中可以使用貼壁細(xì)胞,或者是3D培養(yǎng)的細(xì)胞。用于趨化的細(xì)胞可以直接注入其中一個(gè)儲(chǔ)液池中(圖一)。
圖一:A待觀察細(xì)胞為貼壁細(xì)胞,受到左邊的儲(chǔ)液池中細(xì)胞影響具有了趨化行為。B待觀察細(xì)胞為3D培養(yǎng)細(xì)胞,在基質(zhì)膠中同樣也受到了儲(chǔ)液池中的細(xì)胞的影響具有趨化行為。
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備:
實(shí)驗(yàn)前一天準(zhǔn)備工作:
為了減少ibidi細(xì)胞趨化載玻片與培養(yǎng)基中的氣泡,將載玻片和培養(yǎng)基提前24小時(shí)放入培養(yǎng)箱中
表三:制備1.6mg/ml 基質(zhì)膠
操作步驟:
圖一:制備細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液圖示,注意:1)避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會(huì)破壞膠原纖維,不能使用Vortex;2)膠原混合后,離膠凝大約有5分鐘時(shí)間,如果在凝膠后再進(jìn)行操作會(huì)破壞膠原纖維;3)當(dāng)剛加10x MEM到NaHCO3中的時(shí)候會(huì)看到顏色變化,這表明沒有充分反應(yīng),因此加入混合液到膠原蛋白中后要充分混勻。
開始細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前,要準(zhǔn)備一個(gè)濕盒將細(xì)胞趨化載玻片放在濕盒中。可以用一個(gè)放了浸濕的紙巾的10cm培養(yǎng)皿作為濕盒(如圖二)。
貼壁細(xì)胞準(zhǔn)備:
圖三:(A)示意向觀測(cè)通道中加入帶觀測(cè)細(xì)胞懸液。(B)圖表示注液孔的切面圖。
圖四:細(xì)胞貼壁后用無細(xì)胞培養(yǎng)基更換觀測(cè)通道中的培養(yǎng)基。
3D細(xì)胞準(zhǔn)備
圖五:(A)向觀測(cè)通道加入細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液。(B)用同一個(gè)槍頭從另一個(gè)孔中向外細(xì)。(C)注液孔切面圖。(D)將A、B口塞緊,開始趨化實(shí)驗(yàn)。
加入趨化細(xì)胞:
圖六:加入作為趨化因子的細(xì)胞。需先用無細(xì)胞的培養(yǎng)基將儲(chǔ)液池充滿,再逐漸加入細(xì)胞,加入后將所有塞子塞緊靜置一會(huì),再開始實(shí)驗(yàn)。
●對(duì)照,在兩邊儲(chǔ)液池中均加入60μl的無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為空白對(duì)照(-/-),和兩個(gè)儲(chǔ)液池均加入30μl細(xì)胞懸液作為陽(yáng)性對(duì)照(+/+)。
●按說明,將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集。
●將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中,調(diào)整好采集位點(diǎn),開始錄制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
三、圖像處理
1.手動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤
●下載ImageJ,并安裝Manual Tracking模塊
●導(dǎo)入采集的系列圖像到ImageJ中,打開模塊“Manual Tracking”,選擇“Add track”開始記錄細(xì)胞軌跡
●選擇一個(gè)細(xì)胞,按照時(shí)間點(diǎn)單擊細(xì)胞,*點(diǎn)擊后,會(huì)有新窗口跳出來顯示初始位置,以后每次點(diǎn)擊,都將在這個(gè)新窗口中產(chǎn)生一個(gè)該細(xì)胞隨著時(shí)間的新坐標(biāo)
●統(tǒng)計(jì)完足夠的細(xì)胞軌跡后,保存軌跡坐標(biāo)表格
●至少收集30個(gè)細(xì)胞的軌跡才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,避免同一細(xì)胞追蹤兩次,去除由于凋亡會(huì)而不能采集完整的軌跡的細(xì)胞
●可以將“Overlay dots & lines”以.avi格式導(dǎo)出
2)全自動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤
使用ibidi的WimTaxis自動(dòng)分析平臺(tái),將采集的系列圖像上傳到該平臺(tái),幾個(gè)工作日后,會(huì)得到細(xì)胞軌跡的坐標(biāo)表格數(shù)據(jù)結(jié)果。
四、數(shù)據(jù)處理
使用遷移指數(shù)( Forward Migration Indices*,F(xiàn)MIs)作為比較趨化實(shí)驗(yàn)和對(duì)照試驗(yàn)的參數(shù)。在有趨化物的情況下,空白對(duì)照的FMI和與趨化物垂直方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)(FMI┴)應(yīng)是在0點(diǎn)左右。而與趨化物平行方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)(FMI‖)與0點(diǎn)有顯著的區(qū)別表現(xiàn)出了化學(xué)趨向性。同時(shí),使用Rayleigh Test**對(duì)細(xì)胞趨化的方向性進(jìn)行檢驗(yàn)。如果p值大于0.05表示了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的無序性,表明沒有方向性的遷移。此外,遷移速率等參數(shù)也能直接用于分析。
*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)
**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993)